Quinta semana en el IByME

La idea para la experiencia de este jueves era por un lado realizar una PCR en tiempo real, la cual nos permitiría conocer la concentración de cDNA por litro de muestra. Este experimento se realizo con células MCF7(una línea celular específica) que poseían el mismo tratamiento que se les realizó a las células T47D utilizadas para la PCR en tiempo final. El método para realizar la PCR en tiempo real es cuantitativo (ya que la maquina mide la concentración de ADN después de cada ciclo), mientras que la PCR en tiempo final es semi cuantitativo, por lo que la PCR en tiempo real es mucho mas sensible y un mínimo error de pipeteo puede arruinar el experimento.
Para poder realizar esta experiencia se pipetearon en una placa blanca de 96 wells, agua molecular, mix para PCR, primers y cDNA. Luego de esto se llevo la placa a una maquina para PCR en tiempo real (real time), la cual se maneja a través de un software específico que permite ver los ciclos realizados.
Como segunda etapa en este jueves, largamos a correr el gel de la PCR en tiempo final, la cual se había preparado el jueves anterior. En primer lugar preparamos un gel de agarosa 2% (cuanto más alto es el porcentaje del gel, mas pequeño es el tamaño de los poros). Dicho gel de prepara con agar, buffer y bromuro de etidio (este ultimo se intercalara del ADN dando como resultado fluorescencia al revelarlo con UV). Este gel se pone en una cama con peines, para formar calles que servirán luego para sembrar, y al solidificarse se lo cubre con buffer para que no se seque.
Luego tomamos cada una de las muestras, tanto para prolactina como para GAPDH, las mezclamos con buffer (color azul) y las sembramos en cada una de las calles. Por ultimo tapamos la cuba y le dimos electricidad para que las moléculas de ADN, las cuales tienen carga negativa, migren hacia el polo positivo y así puedan separarse los distintos fragmentos por tamaño, quedando "atrapados" en los poros del gel.