Sexta semana en el IByME

Lo primero que hicimos cuando llegamos al laboratorio fue preparar medio de cultivo para células que sería utilizado posteriormente. Después fuimos a ver los resultados de la PCR que habíamos hecho la semana pasada. Pudimos ver únicamente la PCR a tiempo final, ya que la PCR a tiempo real no había podido ser terminada por errores de funcionamiento del equipo.
(Aclaración: los resultados de la PCR serán analizados la semana próxima porque una parte del gel no había corrido correctamente y se decidió realizarlo por segunda vez)

Cuando terminamos de ver los resultados hicimos un Western Blot para identificar proteínas en muestras de células MCF7 e IBH6. Las proteínas presentes en una célula mamaria normal son las : Erk, Stat 5 y Akt, que sirven para distintos procesos celulares como la proliferación, el movimiento y la apoptosis. Sin embargo, en una célula tumoral éstas proteínas tienen una actividad mayor.
El análisis se hizo con células sometidas a distintos tratamientos que podían activar o desactivar las proteínas (sabemos si una proteína está activa o no, porque cuando está activa se fosforila). Se sembraron células MCF7 e IBH6 en una caja de petri para un control. Luego se aplicaron los tratamientos con prolactina, con Dexmedetomidina, y, por último, con una mezcla entre las dos anteriores. A éstas muestras preparadas se les agregó un buffer que separa las células y protege a las proteínas, permitiéndonos levantar las células. Una vez levantadas, se centifugaron para obtener sólo las proteínas.

Nosotras realizamos un gel 12% de poliacrilamida (este gel nos permite separar las proteínas según su peso molecular) y luego observamos cómo se sembraban las muestras y el marcador, en las calles del gel. Una vez terminado el sembrado, conectamos los electrodos para que las proteínas se trasladaran hacia el lado positivo, y así se pudieran separar. Para terminar, se deben transferir las proteínas a una membrana, y luego incubarlas para realizar el revelado.

Quinta semana en el IByME

La idea para la experiencia de este jueves era por un lado realizar una PCR en tiempo real, la cual nos permitiría conocer la concentración de cDNA por litro de muestra. Este experimento se realizo con células MCF7(una línea celular específica) que poseían el mismo tratamiento que se les realizó a las células T47D utilizadas para la PCR en tiempo final. El método para realizar la PCR en tiempo real es cuantitativo (ya que la maquina mide la concentración de ADN después de cada ciclo), mientras que la PCR en tiempo final es semi cuantitativo, por lo que la PCR en tiempo real es mucho mas sensible y un mínimo error de pipeteo puede arruinar el experimento.
Para poder realizar esta experiencia se pipetearon en una placa blanca de 96 wells, agua molecular, mix para PCR, primers y cDNA. Luego de esto se llevo la placa a una maquina para PCR en tiempo real (real time), la cual se maneja a través de un software específico que permite ver los ciclos realizados.
Como segunda etapa en este jueves, largamos a correr el gel de la PCR en tiempo final, la cual se había preparado el jueves anterior. En primer lugar preparamos un gel de agarosa 2% (cuanto más alto es el porcentaje del gel, mas pequeño es el tamaño de los poros). Dicho gel de prepara con agar, buffer y bromuro de etidio (este ultimo se intercalara del ADN dando como resultado fluorescencia al revelarlo con UV). Este gel se pone en una cama con peines, para formar calles que servirán luego para sembrar, y al solidificarse se lo cubre con buffer para que no se seque.
Luego tomamos cada una de las muestras, tanto para prolactina como para GAPDH, las mezclamos con buffer (color azul) y las sembramos en cada una de las calles. Por ultimo tapamos la cuba y le dimos electricidad para que las moléculas de ADN, las cuales tienen carga negativa, migren hacia el polo positivo y así puedan separarse los distintos fragmentos por tamaño, quedando "atrapados" en los poros del gel.

Cuarta semana en el IBYME

Al comenzar el día agregamos timidinia tritiada a las placas incubadas la semana anterior (extendimos los tiempos del experimento para poder hacer todos los procedimientos nosotras mismas), la cual es una fuente de nucleótidos para la replicación de las células Nb2. Vale aclarar que la timidina tritiada es radiactiva por lo que se debimos trabajar con sumo cuidado, teniendo precaución de que no entrara en contacto con nuestra piel.
Luego hicimos las preparaciones necesarias para la realización de una PCR (reacción en cadena de la polimerasa). La PCR se hizo para células T47D (una línea celular específica) tratadas con compuestos adrenergicos (partiendo del RNA total de las células por medio de una reacción de retrotrascripción utilizando una encima retrotranscriptasa, se forma ADN) para obtener cDNA copia (porque es la copia de una cadena de ARNm). Para poder realizar este procedimiento, debimos primero, preparar un protocolo para la PCR del cDNA de las células T47D. Éste consistió en hacer una lista de elementos necesarios para preparar la mix (mezcla de elementos necesarios para lograr las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa) para la PCR y calcular los volúmenes necesarios de cada elemento (buffer, Mg2+, dNTPs, primers y oligoDT) para lograr hacer 22 eppendorfs (11 para medir prolactina y 11 para house keepper, el cual nos demostrará si la célula se encuentra en un correcto funcionamiento). Consiguientemente Luego preparamos las dos mix las cuales servirán para lograr la amplificación de la cadena de cDNA, y por último pusimos los eppendorfs en la cicladora, para amplificar la replicación de estas cadenas de cDNA (esto se logra con ciclos de distintas temperaturas en distintos periodos de tiempo)

Tercer Semana

Lo primero que hicimos fue tomar los medios condicionados que habíamos preparado la semana anterior y centrifugarlos. Luego de centrifugar, tomamos el sobrenadante (medio condicionado) para utilizarlo en el bioensayo de células Nb2.
Luego, contamos las células en una cámara de Neubauer e hicimos las cuentas respectivas para saber la cantidad de células que deberíamos poner en cada celdilla al plaquear(10.000 clulas por well).

Utilizamos dos placas de 96 wells para el experimento. En una colocamos el volumen correspondiente al Nº de células que queremos poner, y volúmenes correspondientes de medio de cultivo, y los distintos medios condicionados. En la segunda también colocamos el volumen correspondiente al Nº de células en cada well, a lo que le agregamos distintas diluciones de prolactina y llevamos a volumen con medio sin suero fetal bovino.

Al terminar de plaquear, pusimos las dos placas en la estufa para finalizar con el experimento.